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      細胞信號通路分析

      細胞信號通路的分析設計的關鍵步驟是蛋白質定量問題。RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術,可以檢測很低拷貝數的RNA,已經廣泛應用于遺傳病的診斷。RT-PCR的關鍵步驟在于RNA的反轉錄,要求RNA模版盡量為完整且不含DNA、蛋白質等雜質。常用的反轉錄酶有兩種,即禽成骨髓細胞性白細胞病毒(avian myeloblastosis virus,AMV)逆轉錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒(moloney murine leukemia vrius,MMLV)逆轉錄酶,以及來自于MMLV逆轉錄酶的兩個組氨酸突體RNA酶,即市售的SuperScript I和SuperScript II。RT-PCR以其靈敏、快速、需要樣本量小等優點,成為人們分析基因表達過程中首選的一種方法。近來,由于實時熒光定量PCR(real-time PCR)的進展,該方法大大拓展了RT-PCR技術的應用范圍。齊氏生物還提供其他RNA定量的方法還有Nothern blotting、NASBA (van Gemen et al. 1994)和bDNA (Urdea 1993)。他們通常應用于測量已知的RNA種類,如病毒基因組RNA。

      1、主要操作步驟
      ①引物和探針的設計以及優化
      ②模板制備
      a:從血液中提取DNA/RNA標本
      b:從組織中提取DNA/RNA標本
      c:從純培養的標本中DNA/RNA標本
      ③反應體系和PCR條件的建立和優化
      ④定量標準曲線的建立
      ⑤ 不同熒光物質反應條件的優化(SYBR Green I、TaqMan、Molecular Beacon、Lightcycler等)
      ⑥ 樣本DNA/cDNA的檢測(包括內參)
      ⑦ 數據處理與統計
      ⑧實驗完成后,提供完整的實驗報告及實驗材料
      2、實時熒光定量PCR的應用
      ①臨床常見病原體的檢測:
      ②食品安檢中病原菌的檢測
      ③動物檢疫中病原體的檢測
      ④腫瘤研究
      a:標志物特異性基因的檢測
      b:微小殘留病變的檢測
      c:腫瘤藥物的耐藥性的檢測
      ⑤基因表達的差異研究:檢測不同細胞/組織的mRNA表達差異
      ⑥細胞因子表達的分析,如白介素、干擾素、CSF、TNF、TGF、MCP-1、MIP-1等
      ⑦遺傳學診斷,如血友病、鐮刀狀貧血病等
      ⑧基因突變及SNP分析

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